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新冠核酸检测操作流程及实验室仪器之离心机
点击次数:1530 发布时间:2020-02-26

疫情的发生,让全国民众的心都悬浮在半空中,除了对自身安全的担忧,对于抗战在一线的医护人员以及检测人员同样有着极大的担心,因为他们所接触的是确诊的病例,稍有不慎即可能感染。

近日,北京协和医院发布了新型冠状病毒核酸检测标准操作流程,供其他符合条件的医疗机构在开展新型冠状病毒核酸检测时参考。

一、个人三级防护穿戴

带一次性帽子、佩戴医用N95口罩、一次性防护服、一次性鞋套、一次性防水靴套、一层乳胶手套、外层一次性隔离衣、防护目镜、第二层乳胶手套、穿戴完毕后应尽快通过专用缓冲间或者走廊,进入核酸提取区(专业核酸提取实验室)。

二、样本灭活处理

新冠核酸检测须有两名工作人员快速通过进入实验室,进行灭活实验操作。生物安全柜内需配备吸水棉与消毒酒精、有条件可配备吸水台布,对样本溢洒时进行紧急处理;打开二级容器,用75%酒精消毒物体表面,检测样本管密闭性后进行灭活处理,灭活条件(56℃,30min,水浴等多种方式),取出酒精灭活管用酒精擦拭外表,将样本放入到生物安全柜内。

三、手工核酸提取

操作人员进入试剂配置区或者单独的洁净实验室。

(一)试剂区准备

根据说明说要求,在AW1中加入无水乙醇130mL,在AW2中加入无水乙醇160mL,计入无水乙醇后及时做好标记,在310μg的Carrier RNA中加入310μL AVE,并颠倒混匀使Carrier RNA充分溶解,就此完成洗液AW1、洗液AW2和Carrier RNA配置,而后通过传递窗传送到样本处理区,或者由专人送到核酸提取实验室中。

二、样本的裂解

用1.5ml的无菌EP管,移液器移取560μl AVL裂解液,加入5.6μl Carrier RNA,加入140μl的已灭活的待提取核酸的待测样本,涡旋振荡15s,室温静止10min。将上述EP管放入离心机内瞬时离心以去除可能残留在EP管盖上的裂解产物,防止污染。裂解完成后,加入560μl无水乙醇,振荡混匀15s,将上述EP管放入离心机内瞬时离心以去除可能残留在EP管盖上的裂解产物,防止污染。

向离心柱加入裂解产物630μl,8000转离心1min(例如NACHT纳赫特离心机NACHT C-30R,文末附相关参数),若离心机在生物安全柜之外,每次使用都需进行外表面消毒。更换新废液收集管,要从离心机中小心取出离心柱,将上层离心柱转移到新收集管中,继续将剩余裂解产物630μl加入离心柱中,若样本体积大于140μl时需重复此步骤,直到全部裂解产物都过柱离心,8000转离心1min,小心将离心柱转移到新的收集管中。

取500μl AW1加入离心柱中(注意,此处加样操作时务必将移液器吸头接触离心柱内壁缓慢加样),8000转离心1min。小心取出离心柱,更换新的收集管。

取500μl AW2加入离心柱中,14000转离心3min,小心取出离心柱,更换新的离心柱上端收集管,置于离心机中使用最大转速离心1min,以确保将AW2中的残液完全离心干净。

取无菌1.5mlEP管收集核酸,将离心柱上端小心放入1.5mlEP管中,取40-60μl的洗脱液AVE加入到离心柱中(注意:洗脱液应尽量全部覆盖住离心柱膜),用EP管管盖盖住离心柱,使用无菌剪刀剪去原离心柱管盖。

室温静止1min,将其放入离心机中8000转离心1min,回收核酸。丢弃离心柱,EP管中即为获取的提取核酸,做好标记与登记。

四、用仪器提取核酸

首先按照说明说准备核酸提取试剂,将200μl灭活样本添加到核酸提取试剂中,根据核酸提取仪的设置程序上机提取核酸,等仪器操作结束,提取核酸完成,回收核酸。

五、PCR体系配置

根据检测样本数量配制体系,将配制好的PCR体系充分混匀并离心后,将其通过传递窗送至样本处理核酸加样区,或单独的样本加样实验室。按照每孔分装20μL反应体系,进行分装,在各孔分别加入5μL待测样本核酸或阴阳对照物(请注意每次检测器包含1个阳性对照和3个阴性对照且阴性对照需随机分布),密封PCR管,有条件时模板加样尽量在单独的生物安全柜进行。

工作人员将配好的PCR管通过传送窗口送至PCR扩增区,或由专人送至PCR扩增实验室,上机检测。

六、上机检测及结果分析

工作人员进入基因扩增分析实验室,从传递窗取出PCR反应管,上机前需混匀并离心反应体系,按试剂盒说明说设置扩增参数并分析判读结果。分析结果时,严格阅读说明说充分了解试剂盒灵敏度、方法学局限性等综合判读实验结果。

为防止扩增污染,反应结束后的PCR扩增管严禁开盖并装入密封带中装入指定的垃圾桶中。

七、检测后的消毒处理

新冠样本处理完成后,工作人员应用75%的酒精消毒处理外层手套并脱下外层手套,放入生物安全柜中的生物垃圾桶中。检测完成后,生物安全柜台面和地面应用0.5-1%的有效氯消毒剂或75%乙醇进行擦拭。将安全柜内产生的医疗垃圾用三层垃圾袋密封,并将其放入指定垃圾桶中,垃圾袋上需标记医疗垃圾信息。实验结束后,生物安全柜以及实验室均要进行紫外灯照射消毒,时间至少30min。

实验操作人员,应有他人用0.5-1%的有效氯消毒剂或75%乙醇对一次性隔离衣均匀喷雾消毒处理,而后脱去隔离衣将新冠检测医用垃圾放入制定垃圾桶中,工作人员在离开二级实验室后,应在缓冲区或走廊按顺序摘脱个人三级防护用品,首先应带新的外层手套,摘掉护目镜并置于75%乙醇中消毒,自上而下、自内向外翻转脱掉一次性防护服,脱去外层手套,摘除口罩、一次性帽子、脱一次性鞋套。脱掉手套,新冠病毒防护服均需进行高压灭菌处理。高压前后医疗垃圾严格区分。

新冠病毒相关垃圾需在120度,30min条件进行湿热高压处理,以高压试纸条变色为有效,而后作为普通医疗垃圾处理。

NACHT  C-30R技术参数:

NACHT  C-30R

比较大转速

30000 r/min

比较大相对离心力

65403 xg

比较大容量

6×100 mL /4×400 mL

功率

700W

显示

LCD显示屏

加减速

0-19

电机

免维护无碳刷变频电机

温度范围

-20℃~+40℃

快速冷却

比较大转速下小于4℃

制冷剂

环保制冷,不含氯氟烃

开盖方式

电动锁定机盖,自动开盖

转子

角转子、水平转子、酶标板转子等

时间控制

10 s ~ 99 h

尺寸(长宽高)

660×630×355 mm

开盖高度

890mm

重量

100 Kg

噪音

<63 dB

可配容量为0.2~85 mL的角转子,0.5~400 mL的水平转子及酶标板转子。

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